белки ABC

Article

July 4, 2022

Белки ABC (ATP-binding cassette transporters, транспортеры ABC) являются членами надсемейства белков, которое является одним из самых больших и старейших семейств с представителями во всех существующих таксономических подразделениях, от прокариот до человека. Транспортеры ABC обычно состоят из нескольких субъединиц, одна или две из которых являются трансмембранными белками и одна или две из которых являются мембраносвязанными АТФазами. Субъединицы АТФазы используют энергию связывания и гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) для перемещения различных субстратов через мембраны либо для захвата, либо для экспорта субстрата. Большинство, хотя и не все, систем также имеют внецитоплазматический рецептор, белок, с которым связывается растворенное вещество. Некоторые гомологичные АТФазы участвуют в процессах, не связанных с транспортом, таких как трансляция РНК и репарация ДНК. Транспортеры ABC считаются частью суперсемейства ABC. Эта точка зрения основана на их белковых последовательностях и на организации их доменов АТФ-связывающей кассеты (ABC), хотя интегральные мембранные белки, вероятно, в какой-то момент эволюционировали независимо, и, таким образом, существует несколько различных белковых семейств. Имеются указания на то, что интегральные мембранные белки экспортеров ABC эволюционировали независимо, по крайней мере, трижды. Экспортеры ABC1 были созданы путем внутригенного трипликации 2 предшественников TMS, что привело к образованию 6 белков TMS. Экспортеры ABC2 возникают в результате внутригенной дупликации предшественника 3 TMS, а экспортеры ABC3 возникают из предшественника 4 TMS, который дублируется либо экстрагенно с образованием двух белков 4 TMS, оба из которых необходимы для транспортной функции, либо внутригенно с образованием 8 или 10 TMS. белки. Эти 10 белков TMS имеют два дополнительных домена TMS между двумя 4 повторяющимися единицами TMS. Точно так же возможно, что интегральные мембранные белки системы захвата АВС возникали независимо не менее трех раз, судя по их трехмерным структурам высокого разрешения. Транспортеры поглощения ABC переносят множество различных питательных веществ, предшественников биосинтеза, редких металлов и витаминов, в то время как экспортеры транспортируют липиды, стеролы, лекарства и множество различных первичных и вторичных метаболитов. Некоторые из этих экспортеров в организме человека способствуют резистентности к опухолям, кистозному фиброзу и ряду других наследственных заболеваний человека. Высокий уровень экспрессии генов, кодирующих отдельные экспортеры, у прокариотических и эукариотических организмов (включая человека) приводит к развитию устойчивости ко многим лекарственным средствам, таким как антибиотики и противораковые средства. У прокариот и эукариот известны сотни транспортеров ABC. Гены ABC необходимы для многих процессов в клетке, а мутации в генах человека вызывают или способствуют ряду серьезных генетических заболеваний. У человека известно 48 генов ABC. Многие из них были охарактеризованы и показаны как причинно-следственные связи с такими заболеваниями, как муковисцидоз, адренолейкодистрофия, болезнь Штаргардта, резистентные к лекарственным средствам опухоли, синдром Дубина-Джонсона, болезнь Биллера, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз, Х-сцепленная сидеробластная анемия, атаксия. персистирующая и гиперинсулинемическая гипогликемия. Транспортеры ABC также вовлечены в множественную лекарственную устойчивость, и по этой причине некоторые из них были первоначально идентифицированы. Когда транспортные белки ABC избыточно экспрессируются в раковых клетках, они могут экспортировать противораковые препараты.

Функция

Транспортеры ABC используют энергию связывания и гидролиза АТФ для транспорта различных субстратов через клеточные мембраны. Они делятся на три основные функциональные категории. У прокариот импортеры опосредуют поступление питательных веществ в клетку. Субстраты, которые могут транспортироваться, представляют собой ионы, аминокислоты, пептиды, сахара и другие молекулы, которые в основном гидрофильны. Трансмембранная область белка ABC защищает гидрофильные субстраты от липидов в мембранном бислое, тем самым открывая путь через клеточную мембрану. У эукариот нет импортеров. Экспортеры или эффлюксеры, присутствующие у прокариот и эукариот, функционируют как насосы, выталкивающие токсины и лекарства из клетки. У грамотрицательных бактерий экспортеры транспортируют липиды и некоторые полисахариды из цитоплазмы в периплазму. Белки третьей подгруппы ABC не являются транспортерами,

Прокариотические белки ABC

Бактериальные транспортеры ABC необходимы для жизнеспособности, вирулентности и патогенности клеток. Например, системы поглощения железа ABC являются важными эффекторами вирулентности. Патогены используют сидерофоры, такие как энтеробактин, для доступа к железу в комплексе с высокоаффинными связывающими белками или эритроцитами. Это высокоаффинные железохелатирующие молекулы, секретируемые бактериями, которые затем реабсорбируются в виде комплексов железо-сидерофор. Ген ChvE-gguAB в Agrobacterium tumefaciens кодирует импортеры глюкозы и галактозы, которые также способствуют вирулентности. Транспортеры жизненно важны для выживания клеток. Они функционируют как белковые системы, противодействующие всем нежелательным изменениям в клетке. Например, потенциально летальное увеличение осмотической силы уравновешивается активацией осмочувствительного переносчика ABC, который опосредует поглощение растворов. Помимо участия в транспорте, часть бактериальных АВС-белков также участвует в регуляции ряда физиологических процессов.Средство веществ, выводимых из клетки бактериальными системами оттока, включает поверхностные компоненты клеточной стенки бактерий (например, капсульные полисахариды, липополисахариды, и тейхоевая кислота), белки, участвующие в бактериальном патогенезе (например, гемолиз: белок, связывающий гем, и щелочные протеазы), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики, бактериоцины, пептидные антибиотики, лекарства и сидерофоры . Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов и биогенез цитохромов. часть бактериальных АВС-белков также участвует в регуляции ряда физиологических процессов.Средство веществ, которые бактериальные системы оттока выводят из клетки, включает поверхностные компоненты бактериальной клеточной стенки (например, капсулярные полисахариды, липополисахариды и тейхоевая кислота), белки, которые участвуют в бактериальном патогенезе (например, гемолиз: белок, связывающий гем, и щелочные протеазы), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики, бактериоцины, пептидные антибиотики, лекарства и сидерофоры. Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов и биогенез цитохромов. часть бактериальных АВС-белков также участвует в регуляции ряда физиологических процессов.Средство веществ, которые бактериальные системы оттока выводят из клетки, включает поверхностные компоненты бактериальной клеточной стенки (например, капсулярные полисахариды, липополисахариды и тейхоевая кислота), белки, которые участвуют в бактериальном патогенезе (например, гемолиз: белок, связывающий гем, и щелочные протеазы), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики, бактериоцины, пептидные антибиотики, лекарства и сидерофоры. Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов и биогенез цитохромов. липополисахариды и тейхоевая кислота), белки, участвующие в бактериальном патогенезе (например, гемолиз: белок, связывающий гем, и щелочные протеазы), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики, бактериоцины, пептидные антибиотики, лекарства и сидерофоры. Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов и биогенез цитохромов. липополисахариды и тейхоевая кислота), белки, участвующие в бактериальном патогенезе (например, гемолиз: белок, связывающий гем, и щелочные протеазы), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики, бактериоцины, пептидные антибиотики, лекарства и сидерофоры. Они также играют важную роль в путях биосинтеза, включая биосинтез внеклеточных полисахаридов и биогенез цитохромов.

Эукариотические белки ABC

Хотя эукариотические транспортеры ABC в основном являются эффлюксерами, некоторые из них не участвуют непосредственно в транспорте субстрата. В трансмембранном регуляторе муковисцидоза (CFTR) и в рецепторе сульфонилмочевины (SUR) гидролиз АТФ связан с регуляцией открытия и закрытия ионных каналов, осуществляемой самими белками ABC или другими белками.Переносчики ABC человека участвуют в ряде заболеваний. вызван полиморфизмом генов ABC и редко из-за полной потери функции отдельных белков ABC. К таким заболеваниям относятся менделевские болезни и сложные генетические нарушения, такие как муковисцидоз, адренолейкодистрофия, болезнь Штаргардта, болезнь Танжера, иммунодефицит, прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз, синдром Дабина-Джонсона, эластическая псевдоксантома, персистирующая гиперинсулинемическая гипогликемия в детском возрасте вследствие очаговой аденоматозной гиперплазии, Х-сцепленного сидеробластоза и анемии, возрастной макулодистрофии, семейной гипоапопротеинемии, пигментного ретинита, конусо-палочковой дистрофии и др. Семейство ABCB человека (MDR/TAP) ответственно за множественную лекарственную устойчивость (MDR) ко множеству структурно несвязанных препаратов. Р-гликопротеины ABCB1 или MDR1 также участвуют в других биологических процессах, основной функцией которых является транспорт липидов. Установлено, что они опосредуют секрецию стероидного альдостерона в надпочечниках, а его ингибирование блокируется миграцией дендритных иммунных клеток, что, вероятно, связано с секрецией липидов ФАТ. Известно, что ABCB1 опосредует транспорт кортизола и дексаметазона, но не прогестерона и клеток, трансфицированных ABCB1. MDR1 также может транспортировать холестерин, короткоцепочечные и длинноцепочечные аналоги фосфатидилхолина (PC), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS), сфингомиелина (SM) и глюкозилцерамида (GlcCer). Мультиспецифический транспорт различных эндогенных липидов через транспортер MDR1 может влиять на трансбислойное распределение липидов, особенно у видов, которые в норме преобладают на внутренних мембранах.Недавно было показано, что ABC-транспортеры существуют в плаценте, где их роль заключается в защите развивающийся плод от ксенобиотиков.

Структура

Общей чертой всех транспортеров ABC является то, что они состоят из двух отдельных доменов: трансмембранного домена (TMD) и домена, связывающего нуклеотиды (NBD). TMD, также известный как трансмембранный домен (MSD) или интегральный мембранный (IM) домен, состоит из альфа-спиралей, встроенных в бислой мембраны. Он распознает множество субстратов и претерпевает конформационные изменения, чтобы транспортировать субстрат через мембрану. Последовательность и архитектура домена TMD вариабельны, отражая химическое разнообразие транслоцируемых субстратов. Домен NBD или ATP-связывающей кассеты (ABC), напротив, расположен в цитоплазме и имеет высококонсервативную последовательность. NBD содержит сайт связывания АТФ. У большинства экспортеров N-концевой трансмембранный домен и С-концевой домен ABC сливаются в единую полипептидную цепь. организованы в порядке TMD-NBD-TMD-NBD, как, например, в экспортере гемолизина E. coli HlyB. Импортеры имеют обратную организацию, NBD-TMD-NBD-TMD, где домен ABC является N-концевым, а TMD - C-концевым, как, например, в белке MacB E. coli, ответственном за устойчивость к макролидам. Транспортеры ABC состоят как минимум из двух доменов TMD и двух доменов NBD. Четыре отдельные полипептидные цепи, включая две субъединицы TMD и две субъединицы NBD, могут объединяться, образуя полноценный транспортер, как в импортере BtuCD E. coli, участвующем в поглощении витамина B12. Большинство экспортеров, таких как мультилекарственный экспортер Sav1866 из Staphylococcus aureus, образуются из гомодимеров, состоящих из двух полутранспортеров, или мономеров с TMD, слитым с нуклеотидсвязывающим доменом (NBD). Для того, чтобы белок функционировал, часто требуется полный транспортер. Некоторые транспортеры ABC имеют дополнительные элементы, которые способствуют регуляторной функции этого класса белков. В частности, импортеры имеют высокоаффинный связывающий белок (BP), который специфически связывается с субстратом в периплазме для доставки к соответствующему переносчику ABC. Экспортеры не имеют связывающего белка, но имеют внутриклеточный домен (ICD), который соединяет трансмембранные спирали и домен ABC. Считается, что ICD отвечает за связь между TMD и NBD. Экспортеры не имеют связывающего белка, но имеют внутриклеточный домен (ICD), который соединяет трансмембранные спирали и домен ABC. Считается, что ICD отвечает за связь между TMD и NBD. Экспортеры не имеют связывающего белка, но имеют внутриклеточный домен (ICD), который соединяет трансмембранные спирали и домен ABC. Считается, что ICD отвечает за связь между TMD и NBD.

Трансмембранный домен (TMD)

Большинство транспортеров имеют трансмембранные домены, состоящие всего из 12 α-спиралей, по 6 α-спиралей на мономер. Поскольку домены TMD структурно разнообразны, отдельные транспортеры имеют разное количество спиралей (от шести до одиннадцати). Домены ТМ подразделяются на три отдельных набора складок: импортер ABC типа I, импортер ABC типа II и экспортер ABC. Классификация складок импортера основана на подробной характеристике последовательности. Складка импортера ABC типа I первоначально наблюдалась в субъединице ModB TM переносчика молибдата. Эта диагностическая складка также присутствует в субъединицах MalF и MalGTM MalFGK2 и транспортере MetI MetI. В транспортере MetI этот мотив составляет минимальный набор из 5 трансмембранных спиралей, в то время как в ModB и MalG рассеяна одна дополнительная спираль. Общая организация этого мотива представляет собой топологию «вверх-вниз», состоящую из спиралей TM2-5, окружающих транслокационный трек, и спирали TM1, обернутой вокруг поверхности внешней мембраны и контактирующей с другими спиралями TM. Мотив импортера ABC типа II наблюдался в двадцати спиральных доменах TM BtuCD и в Hi1471, гомологичном переносчике из Haemophilus influenzae. В BtuCD упаковка спирали сложная. Заметным паттерном является то, что спираль TM2 занимает положение через центр субъединицы, где она тесно окружена другими спиралями. Спирали TM5 и TM10 расположены на границе TMD. Трансмембранная область экспортеров ABC организована в два "крыла", состоящих из спиралей TM1 и TM2 от одной субъединицы и TM3-6 от другой, в расположении с заменой доменов. Заметной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 с точки зрения приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны. Мотив импортера ABC типа II наблюдался в двадцати спиральных доменах TM BtuCD и в Hi1471, гомологичном переносчике из Haemophilus influenzae. В BtuCD упаковка спирали сложная. Заметным паттерном является то, что спираль TM2 занимает положение через центр субъединицы, где она тесно окружена другими спиралями. Спирали TM5 и TM10 расположены на границе TMD. Трансмембранная область ABC-экспортера организована в два "крыла", состоящих из спиралей TM1 и TM2 от одной субъединицы и TM3-6 от другой, в расположении с заменой доменов. Заметной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 с точки зрения приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны. Мотив импортера ABC типа II наблюдался в двадцати спиральных доменах TM BtuCD и в Hi1471, гомологичном переносчике из Haemophilus influenzae. В BtuCD упаковка спирали сложная. Заметным паттерном является то, что спираль TM2 занимает положение через центр субъединицы, где она тесно окружена другими спиралями. Спирали TM5 и TM10 расположены на границе TMD. Трансмембранная область ABC-экспортера организована в два "крыла", состоящих из спиралей TM1 и TM2 от одной субъединицы и TM3-6 от другой, в расположении с заменой доменов. Заметной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 с точки зрения приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны. Заметным паттерном является то, что спираль TM2 занимает положение через центр субъединицы, где она тесно окружена другими спиралями. Спирали TM5 и TM10 расположены на границе TMD. Трансмембранная область ABC-экспортера организована в два "крыла", состоящих из спиралей TM1 и TM2 от одной субъединицы и TM3-6 от другой, в расположении с заменой доменов. Заметной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 с точки зрения приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны. Заметным паттерном является то, что спираль TM2 занимает положение через центр субъединицы, где она тесно окружена другими спиралями. Спирали TM5 и TM10 расположены на границе TMD. Трансмембранная область ABC-экспортера организована в два "крыла", состоящих из спиралей TM1 и TM2 от одной субъединицы и TM3-6 от другой, в расположении с заменой доменов. Заметной закономерностью является то, что спирали TM1-3 связаны с TM4-6 с точки зрения приблизительно двукратного вращения вокруг оси в плоскости мембраны.

Домен связывания нуклеотидов (NBD)

Домен ABC состоит из двух доменов: каталитического основного домена, такого как RecA-подобные АТФазные моторы, и меньшего, структурно разнообразного α-спирального субдомена, который уникален для транспортеров ABC. Более крупный домен обычно состоит из двух β-плоскостей и шести α-спиралей, содержащих каталитический мотив Уокера A (GXXGXGKS/T, где X — любая аминокислота) или P-петлю и мотив Уокера B (ΦΦΦΦD, где Φ — гидрофобный фрагмент). остаток). Спиральный домен состоит из трех или четырех спиралей и ABC-специфического мотива, также известного как мотив LSGGQ, линкерный пептид или мотив C. Домен ABC также имеет остаток глутамина в гибкой петле, известной как петля Q, крышка или переключатель γ-фосфата, которая соединяет TMD и ABC. Считается, что петля Q участвует во взаимодействии между NBD и TMD. особенно в сочетании с гидролизом нуклеотидов и конформационными изменениями TMD во время транслокации субстрата. Мотив H или область переключения содержит высококонсервативный остаток гистидина, который также важен для взаимодействия домена ABC с АТФ. Название АТФ-связывающая кассета происходит от диагностического расположения или мотива укладки этого класса белков после образования сэндвича АТФ и гидролиза АТФ.

Связывание и гидролиз АТФ

Связывание АТФ необходимо для образования димера двух доменов транспортера ABC. Обычно наблюдается, что АТФ-связанное состояние связано с наиболее протяженным интерфейсом между АВС-доменами, в то время как транспортные структуры без нуклеотидов демонстрируют конформации с большим разделением между АВС-доменами. Структуры АТФ-связанного состояния изолированных доменов NBD известны для импортеров, включая HisP, GlcV, MJ1267, E. coli MalK (EcMalK), T. litoralis MalK (TlMalK), и экспортеров, таких как TAP, HlyB, MJ0796, Sav1866, и МсбА. В этих транспортерах АТФ связан с доменом ABC. Две молекулы АТФ расположены на поверхности димера, между мотивом Walker A одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой. Впервые это наблюдалось в Rad50 и в структурах MJ0796, субъединицы NBD транспортера LolD из Methanococcus jannaschii и переносчика мальтозы EcMalK. Эти структуры также согласуются с результатами биохимических исследований, которые показали, что АТФ находится в более тесном контакте с остатками Р-петли и мотивом LSGGQ во время катализа.Связывание нуклеотидов необходимо для обеспечения электростатической и/или структурной целостности активной сайт и способствовать образованию активного димера NBD. Связывание АТФ стабилизируется за счет следующих взаимодействий: (1) стэкинг-взаимодействие консервативных ароматических остатков, предшествующих мотиву Уокера А, и аденозинового кольца АТФ, (2) водородные связи между консервативным остатком лизина в мотиве Уокера А и кислородом атомы β- и γ-фосфатов АТФ и координация этих фосфатов и отдельных остатков мотива А Уокера с ионом Mg2+, и (3) координация γ-фосфата с сериновой боковой цепью и амидными группами белковой цепи глицина остатки в мотиве LSGGQ. Кроме, мотив, который предполагает тесную связь связывания АТФ и димеризации, представляет собой консервативный гистидин в Н-петле. Этот гистидин вступает в контакт с остатками на другой стороне димерного интерфейса в мотиве А и петле Уокера, консервативной последовательности, которая следует за мотивом Уокера В. Правильное связывание фосфата и расположение γ-фосфата по отношению к атакующей молекуле воды необходимо для ферментативной реакции. гидролиз. В месте связывания нуклеотидов атомы кислорода β- и γ-фосфатов АТФ стабилизированы остатками мотива Walker A и координируются с Mg2+. Ион Mg2+ также координируется с концевым остатком аспартата в мотиве Walker B через атакующую молекулу H2O. Общее основание, которое может представлять собой остаток глутамата, примыкающий к мотиву Уокера B, глутамин в Q-петле или гистидин в области переключения, который образует водородную связь с γ-фосфатом АТФ, катализируют скорость гидролиза АТФ, способствуя атаке H2O. Точный молекулярный механизм гидролиза АТФ до сих пор остается спорным.

Транспортный механизм

Транспортеры ABC являются активными транспортерами. Другими словами, для того, чтобы они могли транспортировать субстраты через клеточные мембраны, им нужна энергия в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Эти белки используют энергию связывания и/или гидролиза АТФ для осуществления конформационных изменений в трансмембранном домене (TMD) и, следовательно, для транспорта молекул. Импортеры и экспортеры ABC имеют общий механизм транспорта субстрата, что является следствием сходства их структур. Механизм, который описывает конформационные изменения из-за связывания субстрата, представляет собой модель переменного доступа. В этой модели сайт связывания субстрата чередуется между внешней и внутренней конформацией. Относительное сродство связывания субстрата этих двух конформаций в значительной степени определяет направление транспорта. Для импортеров, которые перемещают субстрат из периплазмы в цитоплазму, внешняя конформация имеет более высокое сродство к субстрату. Напротив, сродство экспортера к субстрату выше в ориентированной внутрь конформации. Модель, которая описывает конформационные изменения в домене связывания нуклеотидов (NBD) из-за связывания и гидролиза АТФ, является моделью АТФ-переключателя. Эта модель основана на двух основных конформациях NBD: образовании закрытого димера после связывания двух молекул АТФ и диссоциации в открытый димер, обеспечиваемой гидролизом АТФ и высвобождением неорганического фосфата (Pi) и аденозиндифосфата (АДФ). ). Переход между открытой и закрытой конформациями димера вызывает конформационные изменения в TMD, приводящие к транслокации субстрата. Общий механизм транспортного цикла транспортеров ABC полностью не выяснен, хотя имеется значительное количество структурных и биохимических данных, подтверждающих модель, в которой связывание и гидролиз АТФ связаны с конформационными изменениями транспортера. В состоянии покоя все транспортеры ABC имеют домены NBD в открытой конфигурации димера с низким сродством к АТФ. Эта открытая форма имеет камеру, доступную изнутри транспортера. Транспортный цикл инициируется связыванием субстрата с сайтом высокоаффинного связывания на TMD, что вызывает конформационные изменения в доменах NBD и способствует связыванию АТФ. Две молекулы АТФ связываются кооперативно, образуя закрытую димерную конфигурацию. Закрытый димер NBD индуцирует конформационные изменения в доменах TMD, так что TMD открывается, и формирование камеры с отверстием на противоположной стороне от исходного состояния. Сродство субстрата к TMD снижается, и субстрат высвобождается. За этим следует гидролиз АТФ, а затем последовательное высвобождение Pi и затем АДФ, возвращая транспортеру его исходную конфигурацию. Хотя был предложен общий механизм, последовательность связывания субстрата, гидролиза нуклеотидов и конформационных изменений, а также взаимодействие между доменами до сих пор являются предметом активных дискуссий. Обычно считается, что гидролиз АТФ обеспечивает основной ввод энергии или стимул для транспорта и что домены NBD действуют взаимозаменяемо, возможно, участвуя в разных стадиях транспортного цикла. Однако последние структурные и биохимические данные показывают, что связывание АТФ, вместо гидролиза АТФ он обеспечивает стимул. Поскольку связывание АТФ инициирует димеризацию NBD, также возможно, что образование димера является стимулом. У некоторых транспортеров есть NBD-домены, которые не обладают подобными способностями к связыванию и гидролизу АТФ, а их димерный интерфейс NBD состоит из двух сайтов связывания АТФ, что предполагает одновременную функцию двух доменов NBD в транспортном цикле. действительно стимул для транспортного цикла. Было показано, что связывание АТФ вызывает изменения в свойствах связывания субстрата домена ТМ. Трудно напрямую измерить сродство транспортеров ABC к субстратам, а косвенные измерения, например, посредством стимуляции активности АТФазы, часто отражают другие этапы, обуславливающие скорость реакции. Недавно было показано, путем прямого измерения связывания винбластина с пермеазным гликопротеином (P-гликопротеином) в присутствии негидролизуемых аналогов АТФ, например, 5'-аденил-β-γ-имидодифосфата (AMP-PNP), что связывание АТФ в отсутствие гидролиза достаточно, чтобы уменьшить аффинность связывания субстрата. Точно так же связывание АТФ вызывает значительные конформационные изменения в двух доменах TM. Доступность протеаз и спектроскопические исследования перекрестных связей показали, что связывание АТФ с доменами NB вызывает конформационные изменения в белке-1, ассоциированном с множественной лекарственной устойчивостью (MRP1), HisPMQ, LmrA и Pgp. Двумерные кристаллические структуры AMP-PNP-связанного Pgp показали, что основные конформационные изменения во время транспортного цикла происходят после связывания АТФ, а последующий гидролиз АТФ приводит к ограниченным изменениям. Вращение и наклон трансмембранных α-спиралей могут способствовать этим конформационным изменениям. Другие исследования были сосредоточены на поиске доказательств того, что связывание АТФ вызывает образование закрытого димера NBD. Биохимические исследования интактных транспортных комплексов позволяют предположить, что конформационные изменения домена NB относительно невелики. В отсутствие АТФ домены NB могут быть относительно гибкими, хотя значительных переориентаций домена NB по сравнению с другими доменами не происходит. Связывание АТФ индуцирует повороты двух субдоменов ABC относительно друг друга, что позволяет обеспечить правильное выравнивание нуклеотидов в активном сайте и взаимодействие с выделенными мотивами. Имеются убедительные биохимические доказательства того, что связывание двух молекул АТФ может быть кооперативным, другими словами,

Азбука импортеров

Большинство переносчиков ABC, которые опосредуют поглощение питательных веществ и других молекул бактериями, зависят от высокоаффинных белков, связывающих растворенные вещества (BP). Это растворимые белки, расположенные в периплазматическом пространстве между внутренней и внешней мембранами грамотрицательных бактерий. Грамположительные микроорганизмы не имеют периплазмы, поэтому связывающим их белком часто является липопротеин, прикрепленный к внешней поверхности клеточной мембраны. Некоторые грамположительные бактерии имеют белки BP, прикрепленные к трансмембранному домену самого транспортера. Первой успешной кристаллической структурой интактного импортера ABC является переносчик молибдена (ModBC-A) из Archaeoglobus fulgidus. Структуры с атомным разрешением трех других бактериальных импортеров, E. coli BtuCD, переносчика мальтозы E. coli (MalFGK2-E) и предполагаемого переносчика металлохелатов Haemophilus influenza, HI1470/1, также определяются. Эти структуры дают подробные картины взаимодействия трансмембранного домена и домена ABC. Они также обнаруживают две разные конформации с отверстиями в двух разных направлениях. Другим общим свойством импортеров является то, что каждый NBD связан с одним TMD главным образом посредством короткой цитоплазматической спирали домена TM, «спирали связи». Эта часть петли ЕАА расположена на поверхности отверстия, образованного между RecA-подобным и спиральным субдоменами ABC, и лежит примерно параллельно бислою мембраны.

Крупные импортеры ABC

BtuCD и HI1470/1 классифицируются как основные импортеры ABC. Трансмембранная субъединица импортера витамина B12, BtuCD, содержит 10 спиралей TM, а функциональная единица состоит из двух копий, каждая из которых имеет нуклеотидсвязывающий домен (NBD) и трансмембранный домен (TMD). TMD и NBD взаимодействуют друг с другом через цитоплазматическую петлю между двумя спиралями TM и петлей Q в ABC. В отсутствие нуклеотидов имеется два домена ABC и интерфейс димера открыт. Сравнение структур связывающих белков с (BtuCDF) и без (BtuCD) показывает, что BtuCD имеет отверстие в сторону периплазмы, в то время как у BtuCDF внешняя конформация закрыта с обеих сторон мембраны. Структуры BtuCD и гомолога BtuCD, HI1470/1, представляют собой два различных конформационных состояния транспортера ABC. Предсказанный путь транслокации в BtuCD открыт в сторону периплазмы и закрыт в сторону цитоплазмы мембраны, в то время как в HI1470/1 все наоборот, и открытие направлено в сторону цитоплазмы. Различие в структурах заключается в повороте одной субъединицы ТМ на 9° относительно другой.

Мелкие импортеры ABC

Структуры ModBC-A и MalFGK2-E, которые находятся в комплексе со своим связывающим белком, соответствуют малым импортерам ABC. Домены TM ModBC-A и MalFGK2-E имеют только шесть спиралей на субъединицу. Гомодимер ModBC-A находится в конформации, в которой субъединицы ТМ (ModB) ориентированы в виде перевернутой V-образной формы с отверстием, доступным из цитоплазмы. Субъединицы ABC (ModC), с другой стороны, расположены в открытой ненуклеотидной конформации, в которой P-петля одной субъединицы противоположна, хотя и отделена от мотива LSGGQ другой. Связывающий белок ModA находится в закрытой конформации с субстратом, связанным в щели между двумя доменами и связанным с внеклеточными петлями ModB, где субстрат находится непосредственно над закрытым входом транспортера. Структура MalFGK2-E напоминает каталитическое переходное состояние гидролиза АТФ. Он находится в закрытой конформации, состоящей из двух молекул АТФ, зажаты между мотивами Walker A и B одной субъединицы и мотивом LSGGQ другой субъединицы. Белок, связывающий мальтозу (MBP или MalE), расположен на периплазматической стороне субъединиц TM (MalF и MalG), а на границе раздела MalF и MalG можно обнаружить большую экранированную полость. Расположение спирали TM находится в конформации, которая закрыта по отношению к цитоплазме и имеет отверстие наружу. Эта структура предполагает, что MBP, возможно, стимулирует АТФазную активность транспортера после связывания.

Механизм импорта транспорта

Транспортный механизм импортера поддерживает альтернативную модель доступа. Состояние покоя импортера направлено внутрь, где димерный интерфейс нуклеотидсвязывающего домена (NBD) открыт для доменов ТМ, хотя и скрыт от цитоплазмы. После стыковки закрытого связывающего белка с субстратом на периплазматической стороне трансмембранных доменов происходит связывание АТФ и замыкание димера NBD. Это переводит состояние покоя транспортера в конформацию, обращенную наружу, в которой домены TM переориентируются так, чтобы они могли получать субстрат от связывающего белка. После гидролиза АТФ димер NBD открывается, и субстрат высвобождается в цитоплазму. Выпуск ADP и Pi возвращает транспортер в состояние покоя. Единственное несоответствие этого механизма по отношению к модели АТФ-переключателя заключается в том, что конформация в состоянии покоя без нуклеотидов отличается от ожидаемой конформации, обращенной наружу. Хотя это так, ключевым моментом является то, что NBD не димеризуется, если АТФ и связывающий белок не связаны с транспортером.

экспортеры ABC

Экспортеров прокариот ABC предостаточно. Они имеют близких гомологов у эукариот. Этот класс транспортеров классифицируется по типу субстрата, который они транспортируют. Одна группа участвует в экспорте белков (например, токсинов, гидролитических ферментов, белков S-слоя, лантибиотиков, бактериоцинов и факторов компетентности), а другая — в выбросе лекарств. Транспортеры ABC привлекли большое внимание, поскольку они способствуют устойчивости клеток к антибиотикам и противоопухолевым агентам, выкачивая лекарства из клеток.У грамотрицательных организмов транспортеры ABC опосредуют одновременную секрецию белковых субстратов через внутреннюю и внешнюю мембраны без прямого прохождения через мембрану. периплазма. Этот тип секреции называется секрецией типа I, который включает в себя три компонента, которые работают согласованно: экспортер ABC, белок слияния мембран (MFP), и фактор наружной мембраны (OMF). Примером такой секреции является секреция гемолизина (HlyA) из E. coli, где транспортер ABC внутренней мембраны HlyB взаимодействует со слитым белком внутренней мембраны HlyD и фактором наружной мембраны TolC. TolC позволяет транспортировать гемолизин через две мембраны, не контактируя с периплазмой.Бактериальная лекарственная устойчивость представляет собой растущую проблему для здоровья. Один из механизмов лекарственной устойчивости связан с усилением оттока антибиотиков из бактериальных клеток. Лекарственная устойчивость из-за опосредованного Р-гликопротеином оттока первоначально наблюдалась в клетках млекопитающих. Что касается бактерий, Леви и его коллеги впервые опубликовали доказательства того, что устойчивость к антибиотикам вызывается оттоком лекарств. P-гликопротеин является наиболее изученным насосом оттока и, как таковой, дает существенное представление о механизме бактериального насоса. Хотя некоторые транспортеры транспортируют определенный тип субстрата, большинство транспортеров транспортируют различные классы лекарств со значительно различающимися химическими структурами. Эти транспортеры в совокупности называются транспортерами ABC с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и иногда называются «гидрофобными поглотителями».

P-гликопротеин ABCB1/MDR1 человека

Р-гликопротеин является хорошо изученным белком, который способствует множественной лекарственной устойчивости. Он принадлежит к семейству ABCB человека (MDR/TAP). Он также известен как ABCB1 или MDR1 Pgp. MDR1 состоит из функционального мономера с двумя трансмембранными доменами (TMD) и двумя доменами, связывающими нуклеотиды (NBD). Этот белок может в основном транспортировать катионные или электрически нейтральные субстраты, а также широкий спектр амфифильных субстратов. Структура всего мономера ABCB1 была получена в присутствии и в отсутствие нуклеотидов с помощью электронной криокристаллографии. Без нуклеотидов TMD примерно параллельны и образуют пучок, окружающий центральную пору, с выходом на внеклеточную сторону мембраны. В присутствии негидролизуемого аналога АТФ, AMP-PNP, домены TM значительно реорганизованы с тремя четко разделенными доменами. центральная пора, который окружен доменами ТМ, частично открыт на внутриклеточную сторону с промежутком между двумя доменами, который обеспечивает доступ к субстрату из липидной фазы. Значительное изменение упаковки и возможное вращение спирали TM после связывания нуклеотидов предполагают модель вращения спирали как транспортный механизм.

Транспортеры завода ABCB

Геном модельного растения Arabidopsis thaliana способен кодировать 120 белков ABC, в отличие от 50-70 белков ABC, закодированных в геноме человека и плодовой мушки (Drosophila melanogaster). Белки ABC растений подразделяются на 13 подсемейств в зависимости от размера (полные, половинные или четвертные), ориентации и общего сходства аминокислотной последовательности. Гомологи множественной лекарственной устойчивости (MDR), также известные как P-гликопротеины, представляют собой самое большое подсемейство растений, насчитывающее 22 члена, и второе по величине подсемейство ABC в целом. Подсемейство B транспортеров ABC растений (ABCB) характеризуется своим расположением в клеточной мембране. Растительные транспортеры ABCB характеризовались гетерологичной экспрессией в клетках Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe и HeLa для определения субстратной специфичности. Растительные переносчики ABCB транспортируют фитогормон индол-3-уксусную кислоту (ИУК), также известную как ауксин, который является важным регулятором роста и развития растений. Направленный полярный транспорт ауксина опосредует реакцию растений на стимулы окружающей среды посредством таких процессов, как фототропизм и гравитропизм. Два наиболее изученных переносчика ауксина, ABCB1 и ABCB19, были охарактеризованы как первичные экспортеры ауксина. Другие переносчики ABCB, такие как ABCB4, участвуют в экспорте и импорте ауксина. При низких внутриклеточных концентрациях ауксина ABCB4 поглощает ауксин до тех пор, пока не будет достигнут определенный уровень, после чего направление транспорта меняется. Направленный полярный транспорт ауксина опосредует реакцию растений на стимулы окружающей среды посредством таких процессов, как фототропизм и гравитропизм. Два наиболее изученных переносчика ауксина, ABCB1 и ABCB19, были охарактеризованы как первичные экспортеры ауксина. Другие переносчики ABCB, такие как ABCB4, участвуют в экспорте и импорте ауксина. При низких внутриклеточных концентрациях ауксина ABCB4 поглощает ауксин до тех пор, пока не будет достигнут определенный уровень, после чего направление транспорта меняется. Направленный полярный транспорт ауксина опосредует реакцию растений на стимулы окружающей среды посредством таких процессов, как фототропизм и гравитропизм. Два наиболее изученных переносчика ауксина, ABCB1 и ABCB19, были охарактеризованы как первичные экспортеры ауксина. Другие переносчики ABCB, такие как ABCB4, участвуют в экспорте и импорте ауксина. При низких внутриклеточных концентрациях ауксина ABCB4 поглощает ауксин до тех пор, пока не будет достигнут определенный уровень, после чего направление транспорта меняется.

Сав1866

Первой опубликованной структурой экспортера ABC с высоким разрешением была структура Sav1866 из Staphylococcus aureus. Sav1866 является гомологом транспортера множественных лекарств ABC. Он имеет значительное сходство последовательностей с переносчиками ABC подсемейства B человека, которые включают MDR1 и TAP1/TAP2. АТФазная активность переносчика Sav1866 стимулируется противоопухолевыми препаратами, такими как доксорубицин, винбластин и др., что предполагает аналогичную субстратную специфичность с Р-гликопротеином и, следовательно, возможный общий механизм транслокации субстрата. Sav1866 представляет собой гомодимер полутранспортера, каждая субъединица которого содержит N-концевую шестиспиральную TMD и C-концевую NBD. Домены NB имеют структуру, аналогичную доменам других транспортеров ABC, где два сайта связывания АТФ образуются на границе димера между мотивом Walker A одного NBD и мотивом LSGGQ другого. ADP-связанная структура Sav1866 показывает, что NBD находятся в закрытом димере и что спирали TM разделены на два «крыла», ориентированных к периплазме, образуя обращенную наружу конфигурацию. Каждое крыло состоит из спиралей ТМ1-2 одной субъединицы и ТМ3-6 другой субъединицы. Транспортер содержит длинные внутриклеточные петли (ICL или ICD), которые соединяют домены TM и выходят за пределы липидного двойного слоя в цитоплазму и взаимодействуют с 8D. В то время как импортеры содержат короткую спираль связывания, которая связывается с одной NBD, Sav1866 имеет две внутриклеточные спирали связывания, одна (ICL1) контактирует с доменами NB обеих субъединиц, а другая (ICL2) образует взаимодействия только с противоположной субъединицей NBD. тем самым образуя конфигурацию, открытую наружу. Каждое крыло состоит из спиралей ТМ1-2 одной субъединицы и ТМ3-6 другой субъединицы. Транспортер содержит длинные внутриклеточные петли (ICL или ICD), которые соединяют домены TM и выходят за пределы липидного двойного слоя в цитоплазму и взаимодействуют с 8D. В то время как импортеры содержат короткую спираль связывания, которая связывается с одной NBD, Sav1866 имеет две внутриклеточные спирали связывания, одна (ICL1) контактирует с доменами NB обеих субъединиц, а другая (ICL2) образует взаимодействия только с противоположной субъединицей NBD. тем самым образуя конфигурацию, открытую наружу. Каждое крыло состоит из спиралей ТМ1-2 одной субъединицы и ТМ3-6 другой субъединицы. Транспортер содержит длинные внутриклеточные петли (ICL или ICD), которые соединяют домены TM и выходят за пределы липидного двойного слоя в цитоплазму и взаимодействуют с 8D. В то время как импортеры содержат короткую спираль связывания, которая связывается с одной NBD, Sav1866 имеет две внутриклеточные спирали связывания, одна (ICL1) контактирует с доменами NB обеих субъединиц, а другая (ICL2) образует взаимодействия только с противоположной субъединицей NBD.

MsbA

MsbA является переносчиком множественной лекарственной устойчивости (MDR) ABC и может представлять собой липидную флиппазу. Это АТФаза, которая транспортирует липид А, гидрофобную часть липополисахарида (ЛПС), сахаролипид на основе глюкозамина, который образует внешний монослой наружных мембран большинства грамотрицательных бактерий. Липид А является эндотоксином, поэтому потеря MsbA из клеточной мембраны или мутации, нарушающие транспорт, приводят к накоплению липида А во внутренней клеточной мембране, что приводит к гибели клеток. Он близко гомологичен Р-гликопротеину (Pgp) по белковой последовательности и имеет сходную субстратную специфичность с переносчиком MDR-ABC LmrA из Lactococcus lactis. MsbA из E. coli на 36% идентичен NH2-концевой половине MDR1 человека, что указывает на общий механизм транспорта для амфифатических и гидрофобных субстратов. Ген MsbA кодирует полутранспортер, состоящий из трансмембранного домена (TMD), слитого с нуклеотидсвязывающим доменом (NBD). Он построен как гомодимер с общей молекулярной массой 129,2 кДа. MsbA содержит 6 доменов TM на периплазматической стороне, один домен NB, расположенный на цитоплазматической стороне клеточной мембраны, и внутриклеточный домен (ICD), соединяющий TMD и NBD. Эта консервативная спираль, простирающаяся от сегмента TMD в активный сайт NBD или рядом с ним, в значительной степени отвечает за передачу информации между TMD и NBD. В частности, ICD1 служит консервативной стационарной точкой, вокруг которой может вращаться NBD, обеспечивая диссоциацию и димеризацию NBD во время связывания и гидролиза АТФ. Ранее опубликованные (и теперь отозванные) кристаллические структуры MsbA не соответствовали бактериальному гомологу Sav1866. Структуры были повторно проверены, и было обнаружено, что они содержат ошибку, поэтому полученные модели MsbA были неверными. Недавно были исправлены ошибки и выпущены новые структуры. Состояние покоя E. coli MsbA имеет форму перевернутой буквы «V» с камерой, доступной внутрь транспортера. Димерные контакты концентрируются между внеклеточными петлями, и хотя домены NB отстоят друг от друга на ~50 Å, субъединицы обращены друг к другу. Расстояние между остатками в месте контакта димера было подтверждено экспериментами по сшиванию и исследованиями ЭПР-спектроскопии. Относительно большая камера позволяет транспортировать большие головные группы, такие как присутствующие в липиде А. Для транспорта больших головных групп сахара через мембрану необходимы значительные конформационные изменения. Разница между двумя структурами без нуклеотидов (апо) заключается в смещении спиралей TM4/TM5 на ~30° относительно спиралей TM3/TM6. В закрытом апо-состоянии (от V. cholerae MsbA) домены NB выровнены и хотя и расположены ближе, но не образуют АТФ-сэндвича, а Р-петли противоположных мономеров располагаются рядом друг с другом. По сравнению с открытой конформацией димерный интерфейс домена TM в закрытой, обращенной внутрь конформации имеет обширные контакты. В обеих апо-конформациях MsbA отверстие камеры находится на внутренней стороне. Структура MsbA-AMP-PNP (5'-аденил-β-γ-имидодифосфат) из S. typhimurium сходна с Sav1866. Домены NB в такой конформации со связанным нуклеотидом и обращенные наружу вместе образуют канонический сэндвич с димером АТФ, иными словами, нуклеотид расположен между P-петлей и мотивом LSGGQ. Конформационный переход от MsbA-closed-apo к MsbA-AMP-PNP включает два шага: движение спирали TM4/TM5 на ~10° к TM3/TM6, сближение, но не выравнивание домена NB, за которым следует ~20°. ° вращение спирали TM4/TM5 вне плоскости. Переворот приводит к отделению спирали TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с открытой внутрь на открытую наружу. Следовательно, изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. Смещение спирали TM4 / TM5 на ~ 10 ° в сторону TM3 / TM6, приближающее домен NB, но не выравнивающее, с последующим поворотом спирали TM4 / TM5 из плоскости на ~ 20 °. Переворот приводит к отделению спирали TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с открытой внутрь на открытую наружу. Следовательно, изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. Смещение спирали TM4 / TM5 на ~ 10 ° в сторону TM3 / TM6, приближающее домен NB, но не выравнивающее, с последующим поворотом спирали TM4 / TM5 из плоскости на ~ 20 °. Переворот приводит к отделению спирали TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с открытой внутрь на открытую наружу. Следовательно, изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. с последующим поворотом спирали TM4/TM5 из плоскости на ~20°. Переворот приводит к отделению спирали TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с открытой внутрь на открытую наружу. Следовательно, изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. с последующим поворотом спирали TM4/TM5 из плоскости на ~20°. Переворот приводит к отделению спирали TM3/TM6 от TM1/TM2, что приводит к изменению конформации с открытой внутрь на открытую наружу. Следовательно, изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно меняют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР. изменения в ориентации и расположении доменов NB резко перестраивают упаковку трансмембранных спиралей и эффективно изменяют доступ к камере изнутри мембраны на доступ снаружи. Структуры, определенные для MsbA, являются основой транспортной модели по районированию. Описанные структуры также подчеркивают динамическую природу экспортеров ABC, которая также вытекает из исследований флуоресценции и ЭПР.

Mehanizam transporta eksportera

Экспортеры ABC имеют транспортный механизм, который согласуется с моделью чередующегося доступа и моделью переключения ATP. В апо-состояниях экспортера конформация ориентирована внутрь, а домены TM и NB относительно далеко друг от друга. В MsbA, например, камера достаточно велика, чтобы принимать сахарные группы из липополисахарида (LPS). Несколько групп ученых выдвинули гипотезу, что связывание субстрата инициирует транспортный цикл. Связывание АТФ, которое вызывает димеризацию NBD и образование сэндвича АТФ, является движущей силой конформационных изменений в доменах ТМ. В белке MsbA группы сахаров изолированы внутри камеры во время «энергетического стимула». Полость выстлана заряженными и полярными остатками, которые, вероятно, сольватированы, образуя энергетически невыгодную среду для гидрофобных субстратов. и энергетически подходит для полярных частей амфифильных соединений или сахарных групп из ЛПС. Поскольку липид не может длительное время быть стабильным в среде камеры, липид А и другие гидрофобные молекулы перемещаются в энергетически более выгодное положение внутри внешнего слоя мембраны. Смещение также может быть вызвано сдвигом жесткого тела домена TM, когда гидрофобные хвосты молекул LPS скользят через липидный бислой. При переупаковке спирали конформация меняется на состояние с отверстием наружу от мембраны. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическую пору и подтолкнуть субстрат к внешнему слою липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение Pi разделяют NB-домены, после чего происходит восстановление состояния покоя и открытие камеры в цитоплазму для следующего цикла. Поскольку липид не может длительное время быть стабильным в среде камеры, липид А и другие гидрофобные молекулы перемещаются в энергетически более выгодное положение внутри внешнего слоя мембраны. Смещение также может быть вызвано сдвигом жесткого тела домена TM, когда гидрофобные хвосты молекул LPS скользят через липидный бислой. При переупаковке спирали конформация меняется на состояние с отверстием наружу от мембраны. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическую пору и подтолкнуть субстрат к внешнему слою липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение Pi разделяют NB-домены, после чего происходит восстановление состояния покоя и открытие камеры в цитоплазму для следующего цикла. Поскольку липид не может длительное время быть стабильным в среде камеры, липид А и другие гидрофобные молекулы перемещаются в энергетически более выгодное положение внутри внешнего слоя мембраны. Смещение также может быть вызвано сдвигом жесткого тела домена TM, когда гидрофобные хвосты молекул LPS скользят через липидный бислой. При переупаковке спирали конформация меняется на состояние с отверстием наружу от мембраны. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическую пору и подтолкнуть субстрат к внешнему слою липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение Pi разделяют NB-домены, после чего происходит восстановление состояния покоя и открытие камеры в цитоплазму для следующего цикла. Смещение также может быть вызвано сдвигом жесткого тела домена TM, когда гидрофобные хвосты молекул LPS скользят через липидный бислой. При переупаковке спирали конформация меняется на состояние с отверстием наружу от мембраны. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическую пору и подтолкнуть субстрат к внешнему слою липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение Pi разделяют NB-домены, после чего происходит восстановление состояния покоя и открытие камеры в цитоплазму для следующего цикла. Смещение также может быть вызвано сдвигом жесткого тела домена TM, когда гидрофобные хвосты молекул LPS скользят через липидный бислой. При переупаковке спирали конформация меняется на состояние с отверстием наружу от мембраны. Гидролиз АТФ может расширить периплазматическую пору и подтолкнуть субстрат к внешнему слою липидного бислоя. Гидролиз второй молекулы АТФ и высвобождение Pi разделяют NB-домены, после чего происходит восстановление состояния покоя и открытие камеры в цитоплазму для следующего цикла.

Роль в множественной лекарственной устойчивости

Известно, что транспортеры АВС играют ключевую роль в развитии множественной лекарственной устойчивости (МЛУ). В случаях МЛУ у пациентов, употребляющих наркотики, в конечном итоге развивается устойчивость не только к препарату, который они принимают, но и к нескольким различным типам наркотиков. Это обусловлено множеством факторов, одним из которых является повышенное выведение препарата из клеток транспортерами ABC. Например, белок ABCB1 (P-гликопротеин) транспортирует из клеток противоопухолевые препараты. Pgp, также называемый MDR1, ABCB1, является прототипом переносчика ABC и наиболее широко изученным геном этого семейства. Известно, что Pgp переносит органические катионные или нейтральные соединения. Было показано, что несколько членов семейства ABCC, также известных как MRP, оказывают MDR-эффект на органические анионные соединения. Наиболее изученным членом семейства ABCG является ABCG2, также известный как BCRP. белок резистентности рака молочной железы), вызывает устойчивость к большинству ингибиторов топоизомеразы I или II, таких как топотекан, иринотекан и доксорубицин. Неясно, как эти белки могут перемещать такие разные лекарства, хотя одна модель (модель гидрофобного пылесоса) утверждает, что в Р-гликопротеине лекарства связываются независимо от липидной фазы на основании их гидрофобности.

Преодоление множественной лекарственной устойчивости

Лекарственная устойчивость является распространенной клинической проблемой, возникающей у пациентов, страдающих инфекционными заболеваниями, и пациентов, страдающих раком. Прокариотические и эукариотические микроорганизмы, а также опухолевые клетки часто устойчивы к лекарствам. МЛУ часто объясняют повышенной экспрессией транспортеров ABC. Ингибирование транспортеров ABC низкомолекулярными соединениями широко изучалось у онкологических больных; однако клинические результаты были неутешительными. В последнее время для реверсии МЛУ в различных моделях опухолей применялись различные стратегии РНКи, и было обнаружено, что эта технология эффективна для реверсии МЛУ, опосредованной ABC-транспортером, в раковых клетках, и поэтому считается многообещающей стратегией преодоления МЛУ с использованием генной терапии.

Физиологическая роль

Помимо вызывающих МЛУ в опухолевых клетках транспортеры АВС также экспрессируются в мембранах здоровых клеток, где они опосредуют транспорт различных эндогенных веществ, а также ряда чужеродных для организма веществ. Например, переносчики ABC, такие как Pgp, MRP и BCRP, ограничивают всасывание многих лекарств из кишечного тракта и перекачивают лекарства из клеток печени в желчь как способ удаления чужеродных веществ из организма. Большое количество лекарств транспортируется самими транспортерами ABC или влияет на транспорт других лекарств через эти белки. Этот второй сценарий может привести к взаимодействию между лекарствами и вызвать изменения в эффекте лекарств.

Методы характеристики взаимодействий транспортеров ABC

Существует несколько типов тестов, позволяющих выявлять взаимодействия транспортеров ABC с эндогенными и ксенобиотическими соединениями. Сложность тестов варьируется от относительно простых мембранных, таких как тест на везикулярный транспорт, тест на АТФазу, до более сложных клеточных тестов и сложных методологий обнаружения in vivo.

Мембранные тесты

Тест везикулярного транспорта обнаруживает транслокацию молекул через переносчик ABC. Мембраны, приготовленные в соответствующих условиях, содержат обратно ориентированные везикулы с сайтами связывания АТФ и сайтами связывания субстрата-транспортера снаружи. Везикулы захватывают транспортные субстраты АТФ-зависимым образом. Для отделения везикул от инкубационного раствора используют быструю фильтрацию с использованием фильтров из стекловолокна или нитроцеллюлозных мембран, при этом испытуемое соединение, захваченное везикулами, остается на фильтре. Количество транспортируемых немеченых молекул определяют методами ВЭЖХ, ЖХ/МС, ЖХ/МС/МС. В качестве альтернативы соединения метят радиоактивным или флуоресцентным способом, чтобы можно было количественно определить оставшуюся на фильтре радиоактивность или флуоресценцию. Различные типы мембран из разных источников (например, клетки насекомых, трансфицированные или выбранные клеточные линии млекопитающих) используются в исследованиях везикулярного транспорта. Мембраны имеются в продаже или могут быть получены из различных клеток или даже тканей, например мембраны канальцев печени. Преимущество этого типа анализа заключается в измерении фактического расположения субстрата через клеточную мембрану. Его недостатком является то, что соединения со средней и высокой пассивной проницаемостью не удерживаются внутри везикул, что затрудняет выполнение прямых измерений транспорта. Анализ везикулярного транспорта можно проводить непрямым способом, поскольку взаимодействующие тестируемые лекарственные средства модулируют скорость транспорта репортерного соединения. Этот тип теста особенно подходит для обнаружения возможных взаимодействий между лекарствами и взаимодействий лекарств с эндогенными субстратами. Эти тесты не чувствительны к пассивной проницаемости соединений и, следовательно, обнаруживают все взаимодействующие соединения. Этот тип анализа не дает информации о том, является ли тестируемое соединение ингибитором переносчика или субстратом переносчика, который подавляет его функцию конкурентным образом. Типичным примером анализа непрямого везикулярного транспорта является обнаружение ингибирования транспорта таурохолата с помощью ABCB11 (BSEP).

Цельноклеточные анализы

Клетки, экспрессирующие переносчики оттока, активно выкачивают субстраты из клеток, что приводит к снижению скорости накопления субстрата, снижению внутриклеточных концентраций в стационарном состоянии или более высокой скорости элиминации субстрата из клеток, насыщенных субстратом. Транспортируемые радиоактивные субстраты или связывающие флуоресцентные красители могут быть измерены непосредственно или косвенно, модуляция накопления тестируемого субстрата (например, флуоресцентного красителя, такого как Rho123 или кальцеин) может быть определена в присутствии тестируемого лекарственного средства. Кальцеин-АМ является производным кальцеина с высокой проницаемостью и легко проникает в неповрежденные клетки, где эндогенные эстеразы быстро гидролизуют его до флуоресцентного кальцеина. В отличие от кальцеина АМ, кальцеин обладает низкой проницаемостью и поэтому задерживается в клетках, где и накапливается. Поскольку кальцеин-АМ является превосходным субстратом транспортеров оттока MDR1 и MRP1, клетки, экспрессирующие транспортеры MDR1 и/или MRP1, выкачивают кальцеин-АМ из клетки до того, как эстеразы смогут его гидролизовать. Результатом является более низкая клеточная скорость накопления кальцеина. Чем выше активность МЛУ в клеточной мембране, тем меньше кальцеина накапливается в цитоплазме. В клетках, экспрессирующих МЛУ, добавление ингибитора МЛУ или субстрата МЛУ в избытке резко увеличивает скорость накопления кальцеина. Множественная транспортная активность отражается как разница между количеством красителя, накопленного в присутствии и в отсутствие ингибитора. При использовании селективных ингибиторов можно наблюдать разницу между транспортной активностью MDR1 и MRP1. Этот анализ можно использовать для проверки лекарств на взаимодействие с переносчиками, а также для количественной оценки активности MDR клеток.

Подсемейства

Человеческие подсемейства

Известно, что у человека присутствуют 48 транспортеров ABC. Организация генома человека разделила их на семь семейств.

АБСА

Подсемейство ABCA состоит из 12 полных транспортеров, разделенных на две подгруппы. Первая подгруппа состоит из семи генов, картированных на шести разных хромосомах. Это ABCA1-4, A7, A12 и A13. Вторая подгруппа состоит из ABCA5-6 и A8-10. Вся подгруппа 2 организована как единый кластер генов на хромосоме 17q24. Гены второй подгруппы отличаются от ABCA1-подобных генов тем, что имеют 37–38 экзонов против 50 экзонов у ABCA1. Подгруппа ABCA1 вовлечена в развитие генетических заболеваний. При рецессивной болезни Танжера белок ABCA1 мутирует. Кроме того, ABCA4 находится в области хромосомы 1p21, которая содержит ген болезни Штаргардта. Было обнаружено, что этот ген сильно экспрессируется в фоторецепторах палочек и что он мутирован у пациентов с болезнью Штаргардта, рецессивным пигментным ретинитом и большинством рецессивных колбочково-палочковых дистрофий.

АБСВ

Подсемейство ABCB состоит из четырех полных транспортеров и двух полутранспортеров. Это единственное человеческое подсемейство, которое содержит полные и половинные транспортеры. ABCB1 (гликопротеин проницаемости, P-gp, Pgp) был обнаружен как белок, который сверхэкспрессируется в некоторых устойчивых к лекарственным средствам опухолевых клетках. Этот гликопротеин кодируется геном ABCB1 у человека. В первую очередь экспрессируется через гематоэнцефалический барьер и печень. Считается, что он участвует в защите клеток от токсинов. Клетки, сверхэкспрессирующие этот белок, обладают множественной лекарственной устойчивостью.

АВСС

Подсемейство ABCC включает тринадцать членов. Девять переносчиков этой группы называются белками множественной лекарственной устойчивости (MRP). Белки MRP широко представлены в природе и выполняют множество важных функций. Известно, что они участвуют в транспорте ионов, секреции токсинов и передаче сигналов. Из девяти белков MRP четыре из них, MRP4, 5, 8, 9 (ABCC4, 5, 11 и 12), имеют типичные четырехдоменные структуры ABC, включающие два трансмембранных домена, за каждым из которых следует связывающий домен. нуклеотидов. Они сокращенно обозначаются как MRP. Остальные 5 белков MRP, MRP1, 2, 6, 7 (ABCC1, 2, 3, 6 и 10) известны как длинные белки MRP. Они содержат дополнительный пятый домен на своем N-конце.CFTR, транспортер, участвующий в муковисцидозе, также считается частью этого семейства. Муковисцидоз возникает после мутации и потери функции CFTR. CFTR переносит ионы хлора и тиоцианата через мембраны эпителиальных клеток. Мутации гена CFTR влияют на функционирование хлорид-ионных каналов в этих клеточных мембранах, что приводит к муковисцидозу и врожденному отсутствию семявыводящих протоков. это семейство белков. Мутации в белке SUR являются потенциальной причиной неонатального сахарного диабета. SUR также является сайтом связывания таких препаратов, как производные сульфонилмочевины, и средств, открывающих калиевые каналы, таких как диазоксид. что приводит к муковисцидозу и врожденному отсутствию семявыносящих протоков.Рецепторы сульфонилмочевины (SUR), которые участвуют в секреции инсулина, а также в нейронных и мышечных функциях, также являются частью этого семейства белков. Мутации в белке SUR являются потенциальной причиной неонатального сахарного диабета. SUR также является сайтом связывания таких препаратов, как производные сульфонилмочевины, и средств, открывающих калиевые каналы, таких как диазоксид. что приводит к муковисцидозу и врожденному отсутствию семявыносящих протоков.Рецепторы сульфонилмочевины (SUR), которые участвуют в секреции инсулина, а также в нейронных и мышечных функциях, также являются частью этого семейства белков. Мутации в белке SUR являются потенциальной причиной неонатального сахарного диабета. SUR также является сайтом связывания таких препаратов, как производные сульфонилмочевины, и средств, открывающих калиевые каналы, таких как диазоксид.

АВСD

Подсемейство ABCD состоит из четырех генов, кодирующих гемитранспортеры, экспрессируемые исключительно в пероксисомах. ABCD1 отвечает за Х-сцепленную форму адренолейкодистрофии (ALD). Это заболевание, характеризующееся нейродегенерацией и дефицитом надпочечников, которое обычно начинается в позднем детстве. Неразветвленные насыщенные жирные кислоты накапливаются в клетках больных АБП, хотя точная роль ABCD1 в этом процессе еще не установлена. Функция других генов ABCD в настоящее время неизвестна. Есть намеки на то, что они имеют сходные функции в метаболизме жирных кислот.

ABCE и ABCF

Эти две подгруппы состоят из генов, которые имеют АТФ-связывающие домены, которые тесно связаны с другими переносчиками ABC, хотя эти гены не кодируют трансмембранные домены. ABCE имеет только одного члена, OABP или ABCE1, который, как известно, распознает отдельные олигодендроциты, образующиеся в ответ на специфические вирусные инфекции. Все члены подгруппы ABCF состоят из пары доменов связывания АТФ.

ABCG

Шесть гемитранспортеров с сайтами связывания АТФ на N-конце и трансмембранными доменами на С-конце составляют подсемейство ABCG. Такая ориентация противоположна всем другим генам ABC. В геноме человека всего 5 генов ABCG, в то время как геном дрозофелии содержит 15, а дрожжей 10 генов. Ген ABCG2 был обнаружен в клеточных линиях, выделенных из-за их высокого уровня устойчивости к митоксантрону и отсутствия экспрессии ABCB1 или ABCC1. ABCG2 может экспортировать антроциклиновые противораковые препараты, такие как топотекан, митоксантрон или доксорубицин. Было обнаружено, что хромосомные транслокации вызывают амплификацию или перестройку гена ABCG2, присутствующего в резистентных клеточных линиях. Нормальная функция белка ABCG2 неизвестна.

Прокариотические подсемейства

Была разработана следующая система классификации трансмембранных переносчиков растворенных веществ:

Импортер

Поглощение ABC-типа проникает

Экспортер

Пермеазы оттока ABC-типа (прокариотические)

Кристаллические структуры

В последние годы был получен ряд водорастворимых доменных структур белка ABC. Они играют важную роль в изучении механизма действия менее известных членов этого семейства белков.

Узнать больше

АТФ-связывающий домен транспортеров АВС Трансмембранный домен транспортеров АВС

Ссылка

Литература

внешние ссылки

Классификация транспортеров ABC в базе данных TCDB ABCdb Archaial and Bacterial ABC Systems, ABCdb ATP-Binding+cassette+transporters в Национальной медицинской библиотеке США по медицинским предметным рубрикам (MeSH)

Original article in Serbian language